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NP40裂解液制備樣本的小妙招

發布時間: 2022-06-28  點擊次數: 98次

NP40裂解液制備樣本的小妙招


NP-40 裂解液是一種比較溫和的細胞組織裂解液。NP-40 裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規的 PAGE、Western、免疫沉淀(immunol precipitation,IP)、免疫共沉淀(co-IP)和 ELISA 等。本產品可以用于動物、植物的細胞或組織樣品,也可以用于真菌或細菌樣品。NP-40 裂解液的主要成分為 Tris(pH7.4),NaCl,1% NP-40,EDTA 以及磷酸酶抑制劑。用NP-40裂解液裂解得到的蛋白樣品,可以用普利萊P1511 BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑,不能用Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度。


儲存:

4℃保存,12 個月有效


制備細胞裂解產物:

1. 800g 4℃離心5分鐘收集培養細胞,而后用預冷的PBS洗滌細胞兩次。估計細胞離心后的體積(PCV, 106 cells=~20 ml, 107 cells =~100 ml PCV);

2. 每50~100 ml PCV加入5倍體積裂解液(250~500 ml),渦旋震蕩10秒,冰浴放置20分鐘;

3. 12000g 4℃離心15分鐘,將上清轉移到新的離心管中,即得細胞總蛋白產物。


制備組織裂解產物:

1. 取50-100 mg組織在冰上剪成碎片,用預冷的PBS洗滌2次離心棄去PBS;

2. 按照每20 毫克組織加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。)

3. 4℃用玻璃勻漿器勻漿20-40次,直到95%的細胞被破碎,渦旋震蕩10秒,冰浴放置20分鐘;

4. 12000g 4℃離心15分鐘,將上清轉移到新的離心管中,即得組織總蛋白產物,可用于后續的免疫沉淀或者Western Blot等實驗。


注意:

1. 在轉移上清液時不要吸入底部的沉淀物;

2. 在做免疫沉淀或免疫共沉淀時最好在實驗前進行蛋白的提取,以避免某些不穩定蛋白的降解;

3. 在該裂解緩沖液中未加入蛋白酶抑制劑,用戶可自行選擇進行添加。


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